https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1878535213000476
1 . معرفی
گیاهان منبع مهمی از مولکول های فعال زیستی برای کشف دارو هستند. مولکول های زیست فعال جدا شده به عنوان مواد اولیه برای سنتز آزمایشگاهی داروها و همچنین مدلی برای تولید ترکیبات فعال بیولوژیکی عمل می کنند. فرآوری فیتوشیمیایی مواد خام گیاهی اساساً برای بهینه سازی غلظت ترکیبات شناخته شده و همچنین حفظ فعالیت آنها مورد نیاز است ( عزیز و همکاران، 2003 ). استخراج گام مهمی در مسیر پردازش فیتوشیمیایی برای کشف ترکیبات زیست فعال از مواد گیاهی است. انتخاب یک روش استخراج مناسب نیز برای استانداردسازی محصولات گیاهی مهم است، زیرا در حذف ترکیبات محلول مطلوب استفاده می شود و موادی که با کمک حلال ها مورد نیاز نیستند کنار گذاشته می شود. علاوه بر این، انتخاب فرآیند استخراج مناسب و بهینهسازی پارامترهای مختلف برای اهداف افزایش مقیاس، یعنی از مقیاس نیمکت تا سطح کارخانه آزمایشی، حیاتی است. تکنیکهای استخراج مختلف که بیشتر مورد استفاده قرار میگیرند شامل تکنیکهای مرسوم مانند خیساندن، نفوذپذیری ، تزریق، جوشانده، استخراج مداوم گرم و غیره است. اخیراً روشهای جایگزین مانند استخراج با حلال به کمک اولتراسوند (UASE)، استخراج حلال به کمک مایکروویو (MASE) و استخراج مایعات فوق بحرانی (SFE) در طول سه دهه گذشته علاقه فزاینده ای به دست آورده اند ( Co et al., 2012 ). استفاده از تکنیک های استخراج سبز مانند UASE ( Wu et al., 2001 , Ahh et al., 2007 )، MASE ( Ganzler et al., 1986a , Ganzler et al., 1986b ) و SFE ( Olanketo et al., 2002 ) فرآوری فیتوشیمیایی گیاهان دارویی در سطح جهانی به سرعت و به طور مداوم در حال افزایش است زیرا این تکنیک ها در مقایسه با روش های سنتی سریع هستند. همچنین این تکنیک ها از نظر مصرف حلال و انرژی سازگار با محیط زیست هستند. عملکرد نیز با استخراج معمولی قابل مقایسه است و در برخی موارد حتی بیشتر است. با این حال، عملکرد عصاره و همچنین فعالیت های زیستی عصاره تهیه شده با استفاده از روش های مختلف استخراج گزارش شده است که در چندین مطالعه متفاوت است ( Hayouni et al., 2007 ).
Withania somnifera (L.) Dunal . ، (Solanaceae ) که معمولاً با نام Ashwagandha شناخته می شود، درختچه ای سبز رنگ است که در مناطق خشک تر هند، پاکستان، افغانستان، سریلانکا، کنگو، آفریقای جنوبی و مصر یافت می شود. در هند، به طور گسترده در مادیا پرادش، اوتار پرادش، پنجاب، گجرات و هاریانا کشت می شود ( Bhatia et al., 1987 ). در آیورودا و سیستم های طب سنتی هند به عنوان راسایانا طبقه بندی می شود . راسایاناها ، جدای از استفاده از آنها برای ارتقای سلامت جسمی و روانی ، دفاع در برابر بیماری ها و جلوگیری از روند پیری را نیز فراهم می کنند ( سینگ و همکاران، 2001 ، بهتاچاریا و همکاران، 2002 ). دبلیو _ از somnifera به عنوان مکمل غذایی استفاده می شود و از جوشانده ریشه آن به عنوان ماده مغذی و ترمیم کننده سلامت برای افراد باردار و سالمندان استفاده می شود. عصاره W . somnifera مخلوط پیچیده ای از تعداد زیادی فیتوکمیکال از جمله ترکیبات فنلی و فلاونوئیدها است . با این حال، اثر فارماکولوژیک ریشه W . somnifera به withanolides نسبت داده می شود ( Rahman et al., 1988 , Chen et al., 1987 , Udayakumar et al., 2010 ). ویتانولیدها مجموعه ای از استروئیدهای طبیعی هستند که حاوی یک لاکتون با یک زنجیره جانبی از نه کربن هستند که عموماً به C-17 متصل هستند. تنوع بخش لاکتون در کلاس های مختلف آنولیدها یافت می شود. اگرچه، ویتانولیدها نیز از گیاهان خانوادههایی مانند Solanaceae ، Taccaceae و Leguminose و همچنین از برخی موجودات دریایی گزارش شدهاند، جنس withania از غنیترین منابع لاکتونهای استروئیدی در طبیعت است ( Srivastava et al., 1992 , Ksebati and Schmitz. ، 1988 ). دبلیو _ عصاره somnifera یادگیری و حافظه را در مدل های حیوانی ارتقا داد ( Dhuley، 2001 )، از دست دادن حافظه ناشی از آسیب اکسیداتیو ناشی از استرپتوزوتوسین را معکوس کرد ( Parihar et al., 2004 ). مطالعات in vitro همچنین نشان داده اند که عصاره آبی ریشه W. somnifera از تشکیل فیبریل β آمیلوئید (A β) جلوگیری می کند. رسوب خارج سلولی فیبرهای پروتئینی تشکیل شده توسط A β، عمدتاً از 40 یا 42 اسید آمینه A β پپتید به عنوان ویژگی های بیماری آلزایمر در افراد مسن توصیف شده است.کومار و همکاران، 2012 ). با توجه به یافتن ارتباط بین روشهای استخراج، عملکرد، فنل کل و محتوای آنولیدها، تحقیق حاضر انجام شد. استخراج با آب و آب الکل به عنوان حلال با استفاده از UASE و MASE انجام شد زیرا در اکثر فرآورده های گیاهی از آب یا آب الکل به عنوان حلال استفاده می شود. استخراج معمولی با استفاده از رفلاکس نیز برای مقایسه عملکرد عصاره و کیفیت فیتوشیمیایی عصاره انجام شد.
2 . مواد و روش ها
2.1 . تهیه مواد گیاهی و عصاره
ریشه های W . somnifera از مزرعه تحقیقاتی اداره تحقیقات گیاهان دارویی و معطر، بوریاوی، آناند، گجرات، هند در سال 2011 جمع آوری شد و در هوا در سایه خشک شد. ریشه های خشک شده در هوا با استفاده از آسیاب برقی به خوبی پودر شدند. برای استخراج معمولی (ریفلاکس)، 5 گرم از مواد گیاهی پودر شده با 50 میلی لیتر آب مقطر در یک فلاسک ته گرد مخلوط شد و حدود 5 ساعت در دمای 100 درجه سانتی گراد رفلاکس شد. به طور مشابه، 5 گرم پودر با اتانول و آب-اتانول (9:1) به طور جداگانه در فلاسک های ته گرد مخلوط شد و به مدت 5 ساعت رفلاکس شد. عصاره های مایع به دست آمده با فیلتراسیون خلاء از باقیمانده جامد جدا شده و با استفاده از یک اواپراتور چرخشی تغلیظ شدند.
برای UASE، 5 گرم از مواد گیاهی پودر شده با 50 میلی لیتر آب مقطر، اتانول و آب-اتانول (9:1) به طور جداگانه در بشر مخلوط شد. استخراج با قرار دادن سه بشر در حمام اولتراسونیک (Bandelin Sonorex، آلمان، 480 W، 35 کیلوهرتز) به مدت 5، 10 و 20 دقیقه انجام شد . آب در حمام اولتراسونیک در دمای اتاق (25 درجه سانتیگراد) به گردش در آمد تا از گرمای بیش از حد ناشی از اولتراسوند جلوگیری شود. مایع رویی به طور مشابه همانطور که در عصاره گیری معمولی توضیح داده شد برای به دست آوردن عصاره خشک UASE از Withania somnifera فرآوری شد . به طور مشابه، برای MASE، 5 گرم از مواد گیاهی پودر شده با 50 میلی لیتر آب مقطر، اتانول و آب-اتانول (9:1) به طور جداگانه در بشر پیرکس مخلوط شد . استخراج با قرار دادن بشر در وسط اجاق روی یک ظرف چرخان و در معرض تشعشعات مایکروویو (LG Electronics، هند، مدل MG-556 P، 1350 W، 2450 MH Z ) به مدت 5، 10 و 20 دقیقه انجام شد. در پایان حرارت دهی، بشر برای تثبیت دما (1 دقیقه) رها شد. مواد رویی مجدداً سانتریفیوژ شده و همانطور که قبلاً توضیح داده شد غلیظ شدند. نمونه های عصاره خشک شده در یک ظرف دربسته در دمای 4 درجه سانتیگراد نگهداری شدند .
2.2 . تعیین میزان فنل کل در عصاره ها
محتویات فنلی کل در عصاره ها به روش اسپکتروفتومتری با روش Folin-Ciocalteau تعیین شد ( Singleton et al. 1999 ). عصاره های خشک شده در آب مقطر (1 میلی گرم در میلی لیتر) بازسازی شدند . معرف Folin-Ciocalteau (0.5 میلی لیتر) به محلول عصاره (0.5 میلی لیتر) اضافه شد و حجم کل با آب مقطر به 8.5 میلی لیتر تنظیم شد. لوله ها به مدت 10 دقیقه در دمای اتاق نگهداری شدند و پس از آن 1.5 میلی لیتر کربنات سدیم (20 درصد) به آن اضافه شد. لوله ها در یک حمام آب در دمای 40 درجه سانتیگراد به مدت 20 دقیقه انکوبه شدند. شدت رنگ آبی ایجاد شده با ثبت جذب در 755 نانومتر با استفاده از اسپکتروفتومتر مرئی UV (Varian, CARY-300 Bio) اندازه گیری شد. همچنین با استفاده از آب مقطر تهیه می شود. برای تعیین کمیت کل فنول در عصاره، منحنی کالیبراسیون استاندارد با استفاده از اسید گالیک تهیه شد . محتوای فنلی کل نمونه های عصاره به صورت میلی گرم اسید گالیک معادل (GAE) در هر گرم عصاره بیان شد.
2.3 . شناسایی و کمی سازی ویآنولیدها و ویتافرین در عصاره ها با استفاده از کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا (HPLC)
ویتانولیدها (ویتانولید A و 12-دئوکسی با استرامونولید) و با آفرین A در عصاره ها با استفاده از HPLC (Shimazdu Prominence UFLC) روی ستون RP-C 18 (Lichrocart، Merck، 250 × 4.6 میلی متر، 5 میکرومتر) اندازه گیری شدند. فاز متحرک شامل استونیتریل (40٪) و 0.1٪ اسید استیک در آب (60٪) در حالت شستشوی ایزوکراتیک با سرعت جریان 1.0 میلی لیتر در دقیقه بود. حجم تزریق 20 میکرولیتر بود. حلال ها با استفاده از خلاء گاز زدایی شدند. نمونه ها برای آنالیز HPLC نیز از طریق فیلتر غشایی 0.45 میکرومتر فیلتر شدند . پیک ها در طول موج 230 نانومتر با استفاده از یک آشکارساز قابل مشاهده UV (SPD-20 A) قابل مشاهده UV نظارت شدند. پیک ها بر اساس زمان ماند با مقایسه زمان ماند استاندارد با آنولید A، 12-دئوکسی با استرامونولید و شناسایی شدند. با آفرین A، محتوای آنها در عصاره ها بر اساس مساحت پیک اندازه گیری شد.
2.4 . سنجش آنتی اکسیدانی
2.4.1 . فعالیت مهار رادیکال با استفاده از روش DPPH
فعالیت مهار رادیکال عصاره W . somnifera تهیه شده توسط رفلاکس، UASE و MASE با استفاده از روش DPPH ارزیابی شد. غلظت های مختلف (معادل 200، 400، 600، 800 و 1000 پی پی ام) از عصاره ها در لوله های آزمایش گرفته شد. حجم کل با افزودن متانول به 8.5 میلی لیتر تنظیم شد. 5.0 میلی لیتر محلول متانولی 0.1 میلی مولار DPPH به این لوله ها اضافه شد و با یک میکسر گردابی به خوبی مخلوط شد. لوله ها به مدت 20 دقیقه در دمای اتاق نگهداری شدند. بلانک مانند بالا بدون عصاره تهیه شد و برای اصلاح پایه از متانول استفاده شد. تغییرات در جذب نمونههای عصاره در طول موج ۵۱۷ نانومتر با استفاده از اسپکتروفتومتر مرئی UV اندازهگیری شد. فعالیت مهار رادیکال (RSA) به عنوان درصد بازدارندگی بیان شد و با استفاده از فرمول زیر محاسبه شد.
2.4.2 . توانایی مهار رادیکال های آزاد با استفاده از یک کاتیون رادیکال پایدار ABTS
فعالیت مهار رادیکال های آزاد با روش رنگ زدایی کاتیون رادیکال ABTS تعیین شد (Re et al., 1999). ABTS در آب به غلظت 7 میکرومولار حل شد و کاتیون رادیکال (ABTS+میکرومولارپتاسیمدر دمای اتاق در تاریکی (12-16ساعت) قبل از استفادهتولید شدبرای سنجش، محلول ABTS+با آب به مقدار جذب 0.02±0.700 در 734نانومتر رقیق شد. پس از افزودن 3.0میلی لیتر محلول رقیق شده ABTS+به 100میکرولیتر محلول عصاره، جذب پس از 6دقیقه ثبت شد.
2.4.3 . محاسبه غلظت IC 50
غلظت عصاره مربوط به مهار 50 درصدی (IC50 ) از منحنی درصد RSA در برابر غلظت عصاره محاسبه شد. اسید اسکوربیک و ترلوکس به عنوان استاندارد استفاده شد. هر نمونه در سه تکرار برای هر غلظت مورد سنجش قرار گرفت.
3 . نتایج و بحث
ترکیبات فعال بیولوژیکی معمولاً با غلظت کم در گیاهان وجود دارند. یک تکنیک استخراج آن است که بتواند عصاره هایی با عملکرد بالا و با حداقل تغییرات در خواص عملکردی عصاره مورد نیاز به دست آورد ( Quispe Candori et al., 2008 ). چندین مطالعه تغییراتی را در فعالیت های بیولوژیکی عصاره های تهیه شده با استفاده از تکنیک های مختلف استخراج گزارش کرده اند. بنابراین، انتخاب روش استخراج مناسب و همچنین حلال بر اساس خواص ماتریس نمونه، خواص شیمیایی آنالیت ها، برهمکنش ماتریس-آنالیت، کارایی و خواص مطلوب ضروری است ( هایونی و همکاران، 2007 ، ایشیدا و همکاران، 2001). ). در استخراج معمولی، گرما از طریق همرفت و رسانش از سطح منتقل می شود، در اینجا، قابلیت استخراج حلال ها عمدتاً به حلالیت ترکیب در حلال، سینتیک انتقال جرم محصول و قدرت برهمکنش املاح/ماتریس با متناظر بستگی دارد. محدودیت در گرما و سرعت انتشار جرم استخراج حلال به کمک اولتراسوند فرآیندی است که از امواج صوتی و حلال های با شدت بالا و فرکانس بالا برای استخراج ترکیبات هدف از ماتریس های مختلف استفاده می کند. خواص فیزیکی و شیمیایی موادی که در معرض امواج فراصوت قرار میگیرند به دلیل انتشار و تعامل امواج صوتی تغییر میکنند، زیرا دیوارههای سلولی گیاه را مختل میکنند، در نتیجه آزادسازی ترکیبات قابل استخراج را تسهیل میکنند و انتقال جرم حلال را از فاز پیوسته به سلولهای گیاهی افزایش میدهند. انرژی مایکروویو و حلال ها برای استخراج ترکیبات هدف از ماتریس های گیاهی در مورد استخراج حلال به کمک مایکروویو استفاده می شود. دما و فشار بسیار موضعی می تواند باعث مهاجرت انتخابی ترکیبات هدف از ماتریس به محیط اطراف با سرعت بیشتری شود. بازیابی ها در UASE و MASE در مقایسه با استخراج معمولی مشابه یا بهتر هستند. با این حال، کاهش زمان استخراج و مصرف حلال از مزایای اصلی UASE و MASE است. اگرچه استخراج ترکیبات فعال زیستی از گیاهان به طور گسترده با استفاده از استخراج با حلال معمولی مورد بررسی قرار گرفته است، تحقیق حاضر به منظور بررسی تأثیر روشهای استخراج بر عملکرد و کیفیت فیتوشیمیایی W . somnifera .
بازده عصاره W . ریشه somnifera تهیه شده با روش های رفلاکس، UASE و MASE با استفاده از آب، اتانول و آب-اتانول در جدول 1 خلاصه شده است . بازده استخراج (جرم عصاره/ جرم ماده خشک) به عنوان شاخصی از اثرات شرایط استخراج استفاده شد. در رفلاکس، بازده عصاره آب (9.51 درصد) حداکثر به دنبال آب-اتانول و اتانول بود. برای UASE و MASE از سه دوره زمانی 5، 10 و 20 دقیقه استفاده شد. برای UASE نیز، روند مشابهی بود که در مورد رفلاکس مشاهده شد. اما بازده عصاره با اتانول (17/3 درصد، 20 دقیقه) حدود 74/3 برابر کمتر از حداکثر بازده عصاره (85/11 درصد) به دست آمده با آب در 15 دقیقه بود. احتمالاً این می تواند به دلیل قطبیت بالاتر آب و همچنین در دمای استخراج بالا باشد، همانطور که در مورد UASE و MASE، آب دارای ثابت دی الکتریک مشابه حلال های آلی مانند متانول و استونیتریل است . در مورد MASE، بازده عصاره با زمان قرار گرفتن در معرض تابش مایکروویو افزایش یافت و آب (13.02٪، 20 دقیقه) و آب-اتانول (13.75٪، 20 دقیقه) قابل مقایسه بودند. حداکثر بازده UASE و MASE بالاتر از حداکثر بازده عصاره با استفاده از رفلاکس بود. تولید گرمای مستقیم در حجم با تأثیر قابل توجهی بر سینتیک گرمایش و همچنین تأثیر فشار بر ساختار غشای دیواره سلولی که منجر به انتشار یا سرعت تقسیم بالاتر و سریعتر املاح از ماتریکس جامد به حلال می شود، ممکن است دلیل محتمل باشد. بالاترین عملکرد در MASE ( اسپیگنو و دی، 2009 ، تریگار و همکاران، 2011 ). همچنین بهبود عملکرد عصاره در مورد UASE، ممکن است از نظر اثرات حفره ای ناشی از سونوگرافی با شدت بالا توضیح داده شود ( Li et al., 2004 ).
جدول 1 . عملکرد، فنل کل، با آنولید A، 12-دئوکسی با استرامونولید و مقادیر IC50 عصاره ریشه W. somnifera با استفاده از روشهای مختلف استخراج تهیه شد .
روش استخراج رفتار بازده (٪) فنول کل (mg/g GAE) Withanolide A (μg/mg) 12 دئوکسی با آسترامونولید (μg/mg) کل آنولیدها (μg/mg) IC50 (mg/ml) سلول خالی
سلول خالی سلول خالی سلول خالی سلول خالی سلول خالی سلول خالی سلول خالی DPPH ABTS
رفلاکس (سوکسلت) اتانول 9.08 35.93 3.57 1.22 4.79 0.18 1.05
آب: اتانول 9.43 21.15 1.25 0.40 1.65 0.39 2.04
اب 9.51 17.63 1.14 0.36 1.50 0.40 2.14
UASE اتانول _ 2.85 24.72 6.04 2.04 8.09 0.21 1.24
اتانول _ 2.96 25.27 6.58 2.08 8.66 0.20 1.21
اتانول _ 3.17 29.15 6.08 1.94 8.02 0.18 1.20
آب: اتانول 9.74 21.15 1.21 0.41 1.62 1.03 2.54
آب: اتانول 8.96 21.39 1.48 0.47 1.95 0.99 2.53
آب: اتانول 9.08 22.12 1.84 0.62 2.46 0.97 2.51
آب _ 9.90 14.90 0.91 0.26 1.16 1.20 2.68
آب _ 11.85 15.81 0.81 0.23 1.04 1.19 2.64
آب . 10.27 18.18 0.67 0.20 0.87 1.17 2.62
MASE اتانول _ 10.01 40.96 4.35 1.39 5.73 0.15 0.83
آب: اتانول 11.39 20.84 1.09 0.28 1.36 0.73 2.11
آب: اتانول 12.81 21.81 0.97 0.29 1.26 0.66 2.09
آب: اتانول 13.75 22.90 1.00 0.30 1.31 0.62 2.07
آب _ 11.18 17.15 0.59 0.20 0.79 0.70 2.42
آب _ 12.74 17.99 0.67 0.23 0.90 0.69 2.39
آب . 13.02 18.72 0.69 0.19 0.89 0.68 2.36
+
میانگین سه تکرار
.
5 دقیقه
.
10 دقیقه
.
20 دقیقه
محتوای فنل کل در عصاره تهیه شده با اتانول (35.93 GAE mg/g) و سپس آب-اتانول (21.15 GAE mg/g) و آب (17.63 GAE mg/g) حداکثر بود. در مورد UASE و UASE با زمان نوردهی افزایش یافت، اما روند مشابهی با عصاره تهیه شده با استفاده از رفلاکس مشاهده شد.
محتوای ویتانولید A، 12-دئوکسی با استرامونولید و با آفرین A ( شکل 1 ) در عصاره ها با استفاده از HPLC فاز معکوس اندازه گیری شد و کروماتوگرام مخلوط استاندارد در شکل 3 نشان داده شده است . Withaferin A، 12-deoxy withastramonolide و Withanolide A به ترتیب در زمان ماند 9.32، 11.46 و 14.26 دقیقه شناسایی شدند. با این حال، ویتافرین A در عصاره ها تشخیص داده نشد. محتوای کل آنولید (مجموع با آنولید A و 12-دئوکسی با استرامونولید) عصاره تهیه شده با استفاده از رفلاکس به ترتیب زیر متفاوت است: اتانول > آب- اتانول > آب. برای UASE و MASE نیز، محتوای آنولید کل در عصاره اتانولی در مقایسه با عصاره های آب-اتانولی و آبی بیشتر بود.
دانلود: دانلود تصویر با وضوح بالا (212 کیلوبایت)
دانلود: دانلود تصویر در اندازه واقعی
شکل 1 . ساختار ویآنولید A، 12-دئوکسی ویتاسترومونولید و با آفرین A.
دانلود: دانلود تصویر با وضوح بالا (824 کیلوبایت)
دانلود: دانلود تصویر در اندازه واقعی
شکل 3 . کروماتوگرام HPLC عصاره W . ریشه somnifera با استفاده از (A) رفلاکسینگ (B) UASE و ( C ) استخراج MASE (D) استاندارد با آفرین A ، ( Rt = 9.32 دقیقه )، 12-دئوکسی با استرامونوئید ( Rt = 11.46 دقیقه)، با آنولید A ( Rt = 14.26 دقیقه).
از سنجش DPPH و ABTS برای تعیین فعالیت آنتی اکسیدانی عصاره های مختلف تهیه شده با استفاده از روش های رفلاکسینگ، UASE و MASE استفاده شد. ظرفیت آنتی اکسیدانی عصاره ها بر حسب مقدار IC50 عصاره ها بیان شد و مقدار IC50 پایین مربوط به ظرفیت آنتی اکسیدانی بالا است ( شکل 2 ). در هر دو روش DPPH و ABTS، عصارههای اتانولی کمترین مقدار IC50 را داشتند و به ترتیب زیر متفاوت بودند: اتانول < آب-اتانول < آب. علاوه بر این، قدرت ضد رادیکال عصاره ها (1/IC50 ) در سنجش DPPH ( r2 = 0.73 ) و ABTS ( r2 = 0.86) همبستگی بالایی دارد.
دانلود: دانلود تصویر با وضوح بالا (255 کیلوبایت)
دانلود: دانلود تصویر در اندازه واقعی
شکل 2 . مقادیر IC50 سنجش DPPH و ABTS برای فعالیت مهار رادیکالهای آزاد عصارههای تهیهشده با استفاده از (A) رفلکس (B) UASE (C) MASE.
4 . نتیجه
این نتایج نشان میدهد که روشهای استخراج با حلال به کمک امواج فراصوت و مایکروویو میتوانند جایگزین مناسبی برای روشهای استخراج سنتی باشند. با این حال، برای اهداف کاربردی صنعتی، تحقیقات بیشتری برای توسعه یک مدل ریاضی برای کنترل و پیشبینی پارامترهای بهینهسازی فرآیند استخراج مورد نیاز است. تکنیکهای استخراج سبز علاوه بر بهبود عملکرد و کیفیت میتوانند در انرژی و زمان صرفهجویی کنند.
سپاسگزاریها
تشکر صمیمانه خود را از رئیس اداره تحقیقات گیاهان دارویی و معطر، بوریاوی، آناند برای حمایت و تشویق مداوم برای انجام کار تحقیقاتی حاضر ابراز می کنیم. کمک فنی ارائه شده توسط Shri BK Mishra نیز تایید شده است.
